对基因片段测序结果表示不解,求大神指导
我对炭疽属真菌的CHS(编号D)、TUB2(编号E)、CAL(编号F)三个基因片段分别进行了PCR扩增,并送公司测序。但是对测序结果表示很不理解,问题如图中标注: http:// http://
问题说明
【1】图1中,样品D3、D5、D7、D11在胶图中显示为清晰的单一条带,但测序结果全部为“正向双峰”,请问造成这种结果的原因会有哪些?胶图显示为单一条带,但是测序结果为“正向双峰”,但是反向正常,这种现象是什么原因呢?
【2】图2中样品E4、E2、E6、E10、E11在胶图中显示为清晰的单一条带,但测序结果全部为“反向双峰”,但正向是正常的。请问这是什么原因呢?
样品E9、E5、E7、E8条带清晰,但是结果为“双峰无条带,无法回收”,样品F2、F5也有清晰条带,测序结果为“信号弱\无信号”,请问造成上述结果的原因是什么呢? 返回小木虫查看更多
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可能情况1:
重复序列,如polyT、polyA或几个碱基重复
解决办法:
用反向引物测互补链。
可能情况2:
质粒测序在插入序列中出现套峰
解决办法:
可能是样品非单克隆,挑其他测序。
可能情况3:
PCR产物测序中,某一点后序列变乱
解决办法:
可能是存在移码突变,这是正常的,也可以后测序。
可能情况4:
PCR产物中一个或多个位置有套峰
解决办法:
序列中存在突变,这是正常的,也可以后进行测序。
可能情况5:
PCR产物测序前部分双峰
解决办法:
引物二聚体污染或产物不纯,后测序。
可能情况6:
质粒和PCR产物测序出现双峰
解决办法:
引物不纯,测序时只要单一引物,请不要将双向PCR引物混合;合成的引物没有纯化,或纯化不好。重新合成引物测序。
如图中标注,没有看到你的图啊!
谢谢您!
回答的好详细,拿出小本本做笔记受教了!
不好意思,这个帖子可能因为网络的问题,图片显示不出来了。我重新发了一个帖子,这是帖子的链接http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=11592511&target=1
里面补充了图片。谢谢您
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PCR产物 直接送出去测的吗?还是菌液PCR呢
是PCR产物直接送出去测的。切胶回收和测序都由公司做的。
我就有点纳闷,产物图跑得这么漂亮,不至于结果这么不乐观的。
既然PCR产物直接送出去测的,那就比较正常了,这个测序结果与切胶回收关系很大。