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对基因片段测序结果表示不解,求大神指导

作者 米夏girl
来源: 小木虫 1250 25 举报帖子
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我对炭疽属真菌的CHS(编号D)、TUB2(编号E)、CAL(编号F)三个基因片段分别进行了PCR扩增,并送公司测序。但是对测序结果表示很不理解,问题如图中标注: http://\"对基因片段测序结果表示不解,求大神指导\" http://\"对基因片段测序结果表示不解,求大神指导-1\"
问题说明
【1】图1中,样品D3、D5、D7、D11在胶图中显示为清晰的单一条带,但测序结果全部为“正向双峰”,请问造成这种结果的原因会有哪些?胶图显示为单一条带,但是测序结果为“正向双峰”,但是反向正常,这种现象是什么原因呢?
【2】图2中样品E4、E2、E6、E10、E11在胶图中显示为清晰的单一条带,但测序结果全部为“反向双峰”,但正向是正常的。请问这是什么原因呢?

样品E9、E5、E7、E8条带清晰,但是结果为“双峰无条带,无法回收”,样品F2、F5也有清晰条带,测序结果为“信号弱\无信号”,请问造成上述结果的原因是什么呢? 返回小木虫查看更多

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  • 精华评论
  • 晋鹏

    可能情况1:
    重复序列,如polyT、polyA或几个碱基重复
    解决办法:
    用反向引物测互补链。
    可能情况2:
    质粒测序在插入序列中出现套峰
    解决办法:
    可能是样品非单克隆,挑其他测序。
    可能情况3:
    PCR产物测序中,某一点后序列变乱
    解决办法:
    可能是存在移码突变,这是正常的,也可以后测序。
    可能情况4:
    PCR产物中一个或多个位置有套峰
    解决办法:
    序列中存在突变,这是正常的,也可以后进行测序。
    可能情况5:
    PCR产物测序前部分双峰
    解决办法:
    引物二聚体污染或产物不纯,后测序。
    可能情况6:
    质粒和PCR产物测序出现双峰
    解决办法:
    引物不纯,测序时只要单一引物,请不要将双向PCR引物混合;合成的引物没有纯化,或纯化不好。重新合成引物测序。

    如图中标注,没有看到你的图啊!

  • 米夏girl

    引用回帖:
    2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 19:29:59
    可能情况1:
    重复序列,如polyT、polyA或几个碱基重复
    解决办法:
    用反向引物测互补链。
    可能情况2:
    质粒测序在插入序列中出现套峰
    解决办法:
    可能是样品非单克隆,挑其他测序。
    可能情况3:
    PCR产物测序 ...

    谢谢您!
    回答的好详细,拿出小本本做笔记受教了!

  • 米夏girl

    引用回帖:
    2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 19:29:59
    可能情况1:
    重复序列,如polyT、polyA或几个碱基重复
    解决办法:
    用反向引物测互补链。
    可能情况2:
    质粒测序在插入序列中出现套峰
    解决办法:
    可能是样品非单克隆,挑其他测序。
    可能情况3:
    PCR产物测序 ...

    不好意思,这个帖子可能因为网络的问题,图片显示不出来了。我重新发了一个帖子,这是帖子的链接http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=11592511&target=1
    里面补充了图片。谢谢您

  • 晋鹏

    引用回帖:
    4楼: Originally posted by 米夏girl at 2017-08-14 20:45:06
    不好意思,这个帖子可能因为网络的问题,图片显示不出来了。我重新发了一个帖子,这是帖子的链接http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=11592511&target=1
    里面补充了图片。谢谢您。...

    PCR产物 直接送出去测的吗?还是菌液PCR呢

  • 米夏girl

    引用回帖:
    5楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 20:57:09
    PCR产物 直接送出去测的吗?还是菌液PCR呢...

    是PCR产物直接送出去测的。切胶回收和测序都由公司做的。

  • 晋鹏

    引用回帖:
    7楼: Originally posted by 米夏girl at 2017-08-14 21:14:28
    是PCR产物直接送出去测的。切胶回收和测序都由公司做的。...

    我就有点纳闷,产物图跑得这么漂亮,不至于结果这么不乐观的。

    既然PCR产物直接送出去测的,那就比较正常了,这个测序结果与切胶回收关系很大。

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