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以提取的基因组为模板，使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR无果，求助各位大神

作者 长大的小鱼93: 来源: 小木虫 750 15 举报帖子

筛选到一株含有目的酶的菌株，使用NCBI查找到目的酶的基因，以提取的基因组为模板，使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR均未果。期间重新设计过引物，进行过梯度PCR但都没有结果，且每次跑胶结果都特别干净，没有任何条带。实验新手一枚，现在请问各位大神有没有遇到过这种情况？是不是可以用Taq酶进行一下PCR，但我是要PCR获得目的基因送测序，怕Taq酶保真性不高有突变。希望大家可以给出一些建议，一些我可以继续的尝试，谢谢大家了! 返回小木虫查看更多

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精华评论

长大的小鱼93

引用回帖:
7楼: Originally posted by egexig at 2017-10-10 10:04:04
我也有一段目的基因，用基因组作为模板怎么都行不通，换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没？

还没解决呢，现在正在一点点尝试，咨询大家的建议
flhua

是不是基因组上没有你要的基因，基因组有问题，基因片段短的话用菌液为模版都能P出来
长大的小鱼93

引用回帖:
2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试，基因组中残留酚氯仿影响pcr

我提的基因组浓度为147ng/ul，50ul的体系我之前加的1ul，这样浓度会偏高吗？还是我提的基因组浓度太低？
长大的小鱼93

引用回帖:
8楼: Originally posted by luckydog52 at 2017-10-10 12:06:33
这问题我也遇到过，稀释之后确实扩出来了
...

请问你提的基因组浓度有多少啊？我的基因组浓度147ng/ul
flhua

一般我都稀释成终浓度10-50，25ul体系加1ul，或者把题好基因组烘干，再用纯水溶解做模版，或者用培养好菌液做个菌液pcr扩增一个小片段试试，确认目标基因在基因组上
长大的小鱼93

谢谢大家！今天把基因组稀释了10倍和100倍，用Ex Taq酶和primer STAR酶均可以P出条带，万里长征总算迈出一小步了，谢谢大家的指导。
elmanbio

引用回帖:
7楼: Originally posted by egexig at 2017-10-10 10:04:04
我也有一段目的基因，用基因组作为模板怎么都行不通，换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没？

既然知道了目的基因序列，你就多提一点基因组，可以试试直接双酶切以后得到你的序列，然后纯化一下，重新pcr，或者双酶切后克隆至载体上，在pcr
，
luckydog52