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Western膜上有目的条带,但泳道目的条带前后背景较高,是一抗的问题吗?

作者 earthclean
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大家好!最近我在做westernblot。结果中,可以看到目的条带,但泳道目的条带前后都有较高的背景。非泳道背景较低,说明封闭应该不成问题吧?那是不是一抗浓度过高了?或者是一抗与其他蛋白非特异性结合了呢?请帮忙分析一下,不胜感激!

我的步骤如下:
收集细胞:75cm培养瓶,培养基收集至15ml离心管。将2ml预冷PBS倒入培养瓶中,用细胞刮刮下细胞,并把细胞与培养基合并,1000rpm 10min离心收集细胞。弃上清,把细胞移入1.5ml离心管,加入1mlPBS,1000rpm 10min离心收集细胞。
提总蛋白:离心后,弃上清,每管加入400ul裂解液,按照试剂盒说明书裂解细胞,最后收集蛋白溶液。BSA法测蛋白浓度为0.6mg/ml左右。
跑胶:15ul上样,12%分离胶。
转膜:350mA,1小时。蛋白marker完全转至膜上,胶上完全没有marker。
封闭:TBST清洗2次,5min每次。加入封闭液,摇床室温1h。
一抗:不洗膜直接孵育一抗4℃过夜。
二抗:TBST清洗5次,每次5min。孵育二抗,室温1小时。
化学发光:TBST清洗5次,每次5min。ECL发光剂A、B混合后,滴加至膜上,立即放入发光仪观察、拍照。

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  • 精华评论
  • chaosyw

    有可能就是抗体的特异性较差导致的,告诉你的目标蛋白或是所用抗体的公司货号的话或许可以帮你查查这个蛋白在别人SCI中的实验条件,

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