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分子生物学、蛋白表达

作者 吐司布丁7: 来源: 小木虫 650 13 举报帖子

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求助各位大神，最近用BL21表达pET系列重组质粒，用溶菌酶破碎细菌，但是离心之后，SDS-PAGE电泳结果显示上清没有蛋白条带，沉淀里有，课题组的师兄师姐的又没有问题，这是什么情况啊？感谢各位的指点返回小木虫查看更多

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精华评论

18840843935

改变诱导条件试试，就是优化一下条件，诱导剂浓度低一点，温度低一点什么的，目的是慢慢的表达，然后好有时间折叠表达出可溶蛋白
ksws0465326

你反应的条件是啥，LB？还是M9？还是别的，温度，诱导条件（IPTG浓度，诱导时间）每个样本都可能不一样，要具体看，如果是30度培养诱导3小时，可以降低到16到18度，诱导24小时，还有IPTG浓度，从高到低0.6-0.1等，除了这些，培养基也有好些种，每种也不一样。此外，BL21之外还可以用其他的菌株（Rosetta 2），本身DH5a也可以试一试。如果不行，再换载体，pET15，21，28等等。总之，需要条件摸索
吐司布丁7

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2楼: Originally posted by 18840843935 at 2018-01-12 17:30:44
改变诱导条件试试，就是优化一下条件，诱导剂浓度低一点，温度低一点什么的，目的是慢慢的表达，然后好有时间折叠表达出可溶蛋白

诱导条件是：IPTG的终浓度0.1mM，16℃、120rpm,14-16h。
主要是上清几乎没有任何条带，这个跟蛋白表达的诱导条件关系大吗?就算我的目的蛋白没有表达，也应该有一些菌体自身的蛋白条带才对吧？
吐司布丁7

引用回帖:
3楼: Originally posted by ksws0465326 at 2018-01-12 18:10:05
你反应的条件是啥，LB？还是M9？还是别的，温度，诱导条件（IPTG浓度，诱导时间）每个样本都可能不一样，要具体看，如果是30度培养诱导3小时，可以降低到16到18度，诱导24小时，还有IPTG浓度，从高到低0.6-0.1等，除 ...

用的LB培养基，诱导条件是：0.1mM的IPTG,16℃，140rpm，14-16h，现在纠结的问题是，就算我的目的蛋白没有表达，那菌体本身的蛋白应该会有表达吧？拿沉淀来电泳验证了是包涵体表达，就是很不能理解，为什么上清没有条带，我加入的溶菌酶的量有点高，这个会不会有影响
，
hyperwaters

首先，单纯用溶菌酶来裂解，效果很差的，所以你先要确定cell pellets真的裂解了？相差显微镜或结晶紫染色看看裂解效果吧，如果裂解效果很差，你目的蛋白可溶不可溶还另议。另外，减少诱导剂浓度温度加增渗剂葡萄糖都可能改善可溶性。再次，这些措施都不行的话，重新构建表达系统如融合标签gst,mbp，sumo 和分子伴侣折叠酶促溶.
吐司布丁7

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7楼: Originally posted by hyperwaters at 2018-01-13 10:37:44
首先，单纯用溶菌酶来裂解，效果很差的，所以你先要确定cell pellets真的裂解了？相差显微镜或结晶紫染色看看裂解效果吧，如果裂解效果很差，你目的蛋白可溶不可溶还另议。另外，减少诱导剂浓度温度加增渗剂葡萄 ...

感谢大神，我最近在做验证，看看是菌的问题还是我自己的操作问题