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PCR扩增的片段,可以不经酶切直接作为目的基因与载体进行连接么?
PCR扩增的片段,可以不经酶切直接作为目的基因与载体进行连接么?
作者
Korea??
来源:
小木虫
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扩增的片段一般为平端,连接率很低吧?
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快叫爸爸666
肯定要酶切啊,不然不互补,你让它怎么连接
drwhoknowss
可以啊,平端对平端就可以了。不过你要跑胶纯化一下,否则连上的都是引物二聚体
drwhoknowss
引用回帖:
6楼
:
Originally posted by
Korea??
at 2018-01-13 19:50:52
我的载体酶切后,和PCR扩增产物一起跑胶提纯了,也就是说我的载体也应该是被平切了吧?但是连接效果不理想啊,应该引物二聚体很多。
...
要保证你切质粒用的酶能产生平端。还有要用高保真酶,普通taq酶会自动加一个A,不是完美平端。
最后这种平端对平端,不能保证方向。所以50% 的可能DNA在质粒上是反的,不过有时候不重要,看具体情况
,
Korea??
还有这么多问题哦
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肯定要酶切啊,不然不互补,你让它怎么连接
可以啊,平端对平端就可以了。不过你要跑胶纯化一下,否则连上的都是引物二聚体
要保证你切质粒用的酶能产生平端。还有要用高保真酶,普通taq酶会自动加一个A,不是完美平端。
最后这种平端对平端,不能保证方向。所以50% 的可能DNA在质粒上是反的,不过有时候不重要,看具体情况
,
还有这么多问题哦