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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 实验技术 » 求助！！！精子RNA提取！！！！
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【悬赏金币】回答本帖问题，作者yuntaishan2008将赠送您 100 个金币

yuntaishan2008

金虫 (正式写手)

[求助] 求助！！！精子RNA提取！！！！已有2人参与

我最近提精子RNA浓度可以但 A260/A280比值一直上不去，一般在1.5-1.65之间，这是什么问题，求各位大师指导?操作步骤如下：

1、将冷冻精子从液氮罐中迅速取出后，在37 °C水浴锅上30S内解冻到1.5mL无RNA酶的离心管中（样品量160ul），4°C条件下1000 r/min离心3 min,弃上清。2、用DEPC处理过的预冷到4°C的PBS缓冲液洗涤沉淀两次，1000 rpm/min离心3min,弃上清。
3、向沉淀中加入1ml的Trizol，祸旋震荡，在室温下静置5 min。
4、向离心管中加入20 uL β-硫基乙醇,混勻，65°C，水浴30 min,取出后冰浴1 min.。
5、向离心管中加入0.2 mL的氯仿，手动用力震荡15s，室温孵育10min，12000 rpm 4 °C离心15min。
6、离心后溶液分为三层，小心吸取上层水相至新的无RNA酶的离心管中。
7、二次氯仿抽提蛋白
8、向离心管中加入等体积的异丙醇，轻轻反复颠倒混勻，室温静置lOmin, 12000 rpm离心10 min。
9、离心后试管底部会出现沉淀，此为提取出来的RNA。小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入DEPC水配制的75%的乙醇1 mL，切勿触及沉淀，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000 rpm 4 °C离心5 min后小心弃去乙醇。
10、室温干燥燥沉淀2-3 min，使乙醇完全挥发，用30ulDEPC处理的水溶解沉淀后，于-80 °C保存备用。
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1楼2018-04-27 17:35:23
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linhaobua

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

yuntaishan2008
2楼2018-04-27 22:57:45
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yuntaishan2008

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by linhaobua at 2018-04-27 22:57:45
首先A260/A280只是一种指标，不能那么苛求。
A280是蛋白的吸收波长，说明蛋白在抽提的过程中没有抽提干净，在吸取氯仿离心后的上清时要注意，可以少吸取。
最后 ，干燥沉淀的时间还是有些短，可以适当的延长时间
...

谢谢您的热情帮助，我按照您的建议试试啊！如有问题，还望您多多赐教啊！
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3楼2018-04-28 11:08:36
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xiao2189818

金虫 (正式写手)
您好，请问下，您的精子RNA 现在提的效果如何
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4楼2020-07-23 17:08:11
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yuntaishan2008

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiao2189818 at 2020-07-23 17:08:11
您好，请问下，您的精子RNA 现在提的效果如何

效果不好，有待高人指点啊
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5楼2021-07-26 21:00:01
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wodezxn

金虫 (正式写手)
不要做精子RNA，太难做。不能按照其他细胞来对待。降解形式的小片段，量很少。

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6楼2022-08-18 11:26:44
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郝静晨

新虫 (初入文坛)
请问你现在做的怎么样了

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7楼2023-05-12 16:53:24
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liwolf01

铜虫 (小有名气)
外行弱弱的问一下，氯仿那么强烈的东西不会破坏细小的蛋白质结构吗？

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8楼2023-08-11 11:59:37
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fengaiqin

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
还是植物好: 金币+5, 感谢应助 2024-05-27 10:59:22
不知道你提取精子的RNA是用于做什么实验，如果是自己做PCR，应该是没有影响的；如果是送检做转录组的话，目前公司对这个也没有要求了，精子RNA比较特殊，都是小片段，没有核糖体RNA的18s和28s，所以RIN值也没有参考意义
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9楼2024-05-07 11:13:41
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