| 查看: 263 | 回复: 0 | |||
HCCchem
|
[交流]
GPC水相在蛋白质、多肽、透明质酸钠等测试中的应用
|
|
药用辅料是指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂，是药物制剂的基础材料和重要组成部分。 曾出过问题的药品事件多数与药用辅料有关系，比如齐二药事件、铬超标胶囊事件等，看起来是药品的问题，追根溯源是辅料的问题。药用辅料不仅赋予药物一定剂型，而且与提高药物的疗效、降低不良反应有很大的关系。因此，确保药用辅料批次间的一致性、制剂中赋形作用的有效性和质量可靠性尤为重要。药典中也设置了相应的功能性指标对其进行控制，其中包括分子量分布、聚合度等指标。 中国药典第四部2020年版通则中针对分子排阻色谱法提出了一定要求： 分子排阻色谱法： 分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经过修饰的凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex)和琼脂糖凝胶（Sepharose)等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同孔径尺寸的孔，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。 对仪器的一般要求： 分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法(通则0512)，液相色谱泵一般分常压、中压和高压泵。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。 系统适用性试验： 分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法（通则0512）项下方法。 测定法： (1) 分子量测定法 一般适用于蛋白质和多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的标准物质。除另有规定外，标准物质与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT)和十二烷基硫酸钠（SDS)处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以标准物质分子量（Mw )的对数值对相应的保留时间tR ) 制得标准曲线的线性回归方程lgMw = a + btR，供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。 (2) 生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法 生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指标。在测定生物分子聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试品分子结构与性质相同或相似的标准物质十分重要。 示差折光检测器(RID) 工作原理：利用组分与流动相的折光率的不同,其响应信号(R)与组分的浓度(Ci成正比:R=ZCi(ni-n0) ,式中Z为仪器常数, ni为i组分的折光率, n0为流动相的折光率。 优点：通用型检测器,只要组分的折光率与流动相的折光率有足够的差别就能检测。 缺点：灵敏度低、受环境温度、流量及流动相组成等波动的影响大,一般不能用于梯度洗脱。 适用范围：RID为通用型检测器,适用于无紫外吸收化合物的分析,如糖类分析。 多角度光散射检测器 (MALS) 一种静态光散射检测器，可以测量样品的绝对分子量 (Mw) 和可能的旋转半径 (Rg)。 使用 MALS 的最常见方法是连接到 HPLC 尺寸排阻色谱 (SEC) 或凝胶渗透色谱 (GPC) 系统，如 OMNISEC。作为该系统的一部分，还必须连接一个浓度探测器（折射率或紫外线）。 SEC-MALS 检测器可测量样品在多个角度的散射光强，并绘制 Debye 曲线。Debye 曲线对样品散射的角度依赖性进行建模，用于确定色谱图中每个数据切片的 Mw 和 Rg。重要的是，需要仔细考虑为此分析选择的拟合顺序和模型，因为它会对结果产生重大影响。半径小于 10-15nm 的各向同性散射体会在各个方向均匀散射光，这意味着只能测量 Mw。半径大于 10-15nm 的各向异性散射样品，会在正向散射更多的光，从而可以同时测量 Mw 和 Rg。使用 Rg 可以绘制构象图（Rg 对 Mw 的图），可以测量样品之间的任何结构差异。 传统的光散射法只能确定平均分子量，旋转半径及第二维里系数，而 GPC/SEC 又 受泵流速的限制，再加上寻找与待测物结构相似的标准品不易，对低浓度高分子量的部分，如 microgel, trimer, dimer 等信号不敏感，导致误差增大，色谱柱容易老化。而多角度激光光散射仪(MALLS)与 GPC/SEC 结合，正可以互相补充，不但可以直接测得绝对分子量，还可以对样品的组成，从低浓度高分子量到高浓度低分子量，都能解析的很清楚，更可以得到许多有用的信息，如分子的形状，分枝状况，聚集态及动力学参数，反应速率等，其功能与应用普及性正与日俱增。 |
回复此楼» 猜你喜欢
基金评审
已经有3人回复
-
青椒的未来在哪里？
已经有15人回复
-
普通高校有编制讲师与211高校无编制专职科研岗，应该怎么选
已经有25人回复
-
双非博士还是985科研助理，然后再读博
已经有9人回复
-
急求博导收留
已经有14人回复
-
博士去高校就是为了有寒暑假吗？
已经有23人回复
-
连续3年国社科青年本子都没中，今年最后一次青年了，写本子完全浪费时间
已经有23人回复
-
基金委也是打工的
已经有32人回复
-
博三一直没文章怎么办
已经有35人回复
-
被导师抓着一个褥羊毛该咋办
已经有24人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
20