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细胞实验 | 破骨细胞的传代、冻存与复苏
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实验动物 成年SPF级雄性SD大鼠1只， 体重250g。 实验方法及步骤 01 外周血单个核细胞分离 ✦ （1）标本采集：取SPF 成年 SD 大鼠 1 只，3％戊巴比妥钠，按动物体重0.15 ml/100g，腹腔注射麻醉。无菌操作下腹主动脉采血6 ml，注入肝素抗凝管中。 （2）单个核细胞分离：采用密度梯度离心法， 向采集的血样标本内加入等量的PBS，取4支15ml离心管，分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml，再缓缓向各离心管内加入上述含PBS血样各3ml，然后以2000r／min，水平离心20min，取出后在絮状层小心吸取单个核细胞，分别收集到2支离心管中，PBS清洗2次，备作重悬培养。 02 破骨细胞的诱导培养 ✦ 将分离纯化的大鼠周围血单个核细胞，用含10％FBS、50ng／mlRANKL、20ng ／mlM－CSF、100U／ml青霉素、100U／ml链霉素的 α－MEM培养液重悬，调整细胞密度为1×105个／ml。再将配制好的细胞悬液接种到6孔培养板与直径35 mm培养皿中。直径35mm培养皿用于活细胞工作站动态跟踪成像，6孔培养板置 于CO2培养箱内，在37℃、5％CO2、饱和湿度下连续培养，用上述含RANKL、M－CSF的α-MEM 培养液换液，每3日1次。同时对整个培养过程作相差显微镜观察与活细胞成像，培养14 d作抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。 03 破骨细胞的传代 ✦ 大鼠周围血单个核细胞经RANKL、M－CSF 诱导培养2周，形成大量贴壁的多核破骨细胞后，从培养箱中取出，将培养液吸净，加入37 ℃预温的D－Hank＇s液，冲洗2次，再滴加足量的0.25％胰蛋白酶液，使其覆盖整个底面，置于37 ℃培养箱中消化5min后取出，震荡1min左右，在倒置相差显微镜下观察，当大部分细胞收缩悬起后，加入α－MEM完全培养液终止消化，用吸管反复抽吸吹打，将细胞混匀后移入15ml离心管，2000r／min，离心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF的α－MEM完全培养液重悬细胞， 调整浓度至1×105个／ml，接种细胞至6孔培养板与直径35mm 培养皿中。同时对消化与贴壁过程作活细胞成像观察，3d后作TRAP染色。 04 破骨细胞的冻存 ✦ 按破骨细胞传代方法，将诱导培养的破骨细胞制成细胞悬液，2000r／min，离心5min，去上清，用DMSO、FBS、α－MEM 按1∶2∶7 比例配制的冻存液，重悬细胞，调整细胞浓度至5×106个／ml，加入冻存管，每支1.5ml，用冻存罐在温度为－80℃冰箱中放置24h，再移至－196 ℃液氮中冻存。 05 破骨细胞的复苏 ✦ 从液氮中取出冻存的破骨细胞，迅速在 37 ℃水浴中震荡融解，将融解的细胞悬液加入15ml离心管中，再加6ml α－MEM完全培养液，混匀，2000r／min，离心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF 的α －MEM完全培养液，按1×105个／ ml的细胞浓度重悬后，分别接种到6孔培养板与直径35mm培养皿中。同时对接种后的贴壁过程作活细胞成像观察，3d后作TRAP染色。 观察项目与方法 01 活细胞成像观察 ✦ （1）破骨细胞诱导培养的活细胞成像 观察：取直径35mm培养皿，将其置于活细胞工作站倒置显微镜的培养室中，在相差观察模式、20倍物镜下，以1f／6s的采集速度，对整个培养过程作序列图像捕获，进行单帧图像分析与缩时视频动态观察。 （2）破骨细胞传代培养的活细胞成像 观察：取直径35mm培养皿培养的破骨细胞，将其置于活细胞工作站倒置显微镜的培养室中，在相差观察模式、20倍物镜下，选择贴壁良好，胞质充分展开，细胞核清晰可见的多核破骨细胞，调整到视野中心，然后将培养皿中的培养液吸净，再用 37℃预温的D－hank＇s 液缓缓冲洗2遍，吸干。 以1 f／s的采集速度，开始序列图像捕获，同时向培养皿内加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，记录破骨细胞在胰蛋白酶作用下的整个消化过程，约5min。当细胞胞体收缩，呈饱满圆亮、半悬浮状态时，加入2ml α－MEM 完全培养液终止消化，用吸管吹吸，使其形成均匀的细胞悬液，再移入2ml灭菌EP管，2000r／min离心3min，去上清，用含 RANKL、M－CSF 的α－MEM完全培养液重悬细胞，接种到另一个直径35 mm培养皿，放回活细胞工作站的培养室中，再按上述方法选择圆亮饱满、体积较大的多核破骨细胞，置于观察视野中心，以1f／6s采集速度进行序列图像采集，观察破骨细胞传代后的整个贴壁过程。 （3）破骨细胞复苏培养的活细胞成像 观察：破骨细胞复苏培养后，立即取直径35mm培养皿培养的破骨细胞置于活细胞工作站的培养室中，按上述破骨细胞传代后的活细胞成像观察方法，进行序列图像采集，观察破骨细胞复苏培养后的整个贴壁过程。 02 TRAP染色 ✦ 取培养细胞，吸净孔内培养液，用37 ℃预温的PBS冲洗2次，再用2.5％戊二醛常温下固定2min，去离子水漂洗3次。取坚牢石榴红GBC溶液0.1ml和亚硝酸盐溶液0.1ml，轻轻混合30s，静止2min。将上液加入到9ml 预热至37 ℃的去离子水中，再依次加入0.1ml萘酚AS－BI磷酸盐溶液、0.4ml 醋酸盐溶液、0.2ml 酒石酸盐溶液，制得染色液。将染色液加入培养孔内，37℃孵育，注意避光。15min后观察染色效果，呈最佳效果时即终止染色，取出后去离子水冲洗，晾干，倒置显微镜下观察，DP-72 数字成像系统采集图像。 |
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