求助!对基因片段测序结果表示不解,求大神指导
我对炭疽属真菌的CHS(编号D)、TUB2(编号E)、CAL(编号F)三个基因片段分别进行了PCR扩增,并送公司测序。但是对测序结果表示很不理解,问题如图中标注: http://\"对基因片段测序结果表示不解,求大神指导\" http://\"对基因片段测序结果表示不解,求大神指导-1\"
问题说明
【1】图1中,样品D3、D5、D7、D11在胶图中显示为清晰的单一条带,但测序结果全部为“正向双峰”,请问造成这种结果的原因会有哪些?胶图显示为单一条带,但是测序结果为“正向双峰”,但是反向正常,这种现象是什么原因呢?
【2】图2中样品E4、E2、E6、E10、E11在胶图中显示为清晰的单一条带,但测序结果全部为“反向双峰”,但正向是正常的。请问这是什么原因呢?
样品E9、E5、E7、E8条带清晰,但是结果为“双峰无条带,无法回收”,样品F2、F5也有清晰条带,测序结果为“信号弱\无信号”,请问造成上述结果的原因是什么呢?
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今日热帖
我是个小白,不太懂哦~拿到的序列和峰图对比时,一般是要对比些什么呢?有哪些注意事项呀?
求大神指导~
你是克隆到载体测序的还是PCR产物直接测序的,克隆到载体上测序一般不会出现这种情况(通用引物测序),PCR产物测序如果正向重叠峰而反向正常,说明产物是单一的,问题在引物上,测序引物在产物上还有高匹配序列,你可以用正向引物与序列做一个比对,可能还有一个高匹配位点,尤其3'端。
祝你实验顺利
我是直接送了PCR产物测序的,因为样品太多了,图省事,就出现了这么好多问题。我是一个小白,不太懂哦~您说的“你可以用正向引物与序列做一个比对”,这一步骤how to 实施呀?求赐教哦~
我的目的片段比较小,大概是300bp左右,如果正向双峰,是不是只用反向序列就可以了呢
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对的,这么短,只需要测一个方向就可以了,不需要测定双向,不过测序引物那一端有部分是测不出来的,如果不影响的话
习惯就好,让你多测一次。也有可能他们加样没加好,或者用的是胶回收,然后没回收好。都有可能,建议下回用酶纯化法,不要用胶回收
个人感觉还是构建载体比较靠谱,比较片段最后还是要在载体上才能表达,转染等。