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电泳技术：生物化学实验常用技术-2
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琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳，其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅依赖于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大地提高了分辨能力。琼脂糖系天然的琼脂加工制得，天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖（约占80%）及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果，而加工制得的琼脂糖凝胶为支持物进行电泳可以克服琼脂不足之处，其优点如下：1．琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。2．琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99%），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。3．琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量测定。4．电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。琼脂糖凝胶通常制成板状，常用1%琼脂糖作为电泳支持物。电泳缓冲液的pH 在6～9之间，离子强度最适为0.02～0.05。离子强度过高时，将有大量电流通过凝胶，使凝胶中水份大量蒸发，甚至造成凝胶干裂，电泳中应加以避免。由于琼脂糖电泳具有较高分辨率、重复性好，区带易染色、洗脱和定量以及干膜可以长期保存等优点，所以常用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶等同工酶的分离和鉴定，为临床某些疾病的鉴别诊断提供了可靠的依据。与免疫化学反应相结合发展成为免疫电泳技术，用于分离和检测抗原。可对目前常用的琼脂糖进行某些修饰，如引入化学基团羟乙基，则可使琼脂糖在65℃左右便能熔化，被称为低熔点琼脂糖。该温度低于DNA的熔点，而且凝胶强度又无明显改变。以此为支持物进行电泳，称为低熔点琼脂糖凝胶电泳，主要应用于DNA研究。如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂又称为共聚体的N,N’-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。一．聚丙烯酰胺凝胶所具有的优点：1．机械强度好，弹性好，透明，无电渗作用，吸附作用极小。2．化学性能稳定，与待分离物质不起任何化学反应。3．样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。4．凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。5．分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为圆盘电泳、垂直板型电泳、梯度凝胶电泳、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及双向电泳等技术。盘状电泳是在垂直的玻璃管内，利用不连续的缓冲液、pH和凝胶孔径进行电泳而命名的。垂直板型电泳是将聚丙烯酰胺凝胶聚合成薄板状凝胶，竖直进行电泳，其优点是：在同一条件下可电泳多个要比较的样品，重复性好。在聚丙烯酰胺凝胶体系中加入十二烷基硫酸钠（SDS），SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷，从而消除和遮盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，因此它与蛋白质结合后，还可引起蛋白质构,[象的改变。基于此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量有关，可用于蛋白质分子量的测定。 二．凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成，Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在游离基存在时，它们就聚合成凝胶。引发产生游离基的方法有化学法和光学法两种。1．化学聚合常用的催化剂系统有：（1）过硫酸胺——TEMED(四甲基乙二胺)；（2）过硫酸胺——DMPN(二甲基氨基丙腈)；（3）过硫酸胺——三乙醇胺。上述皆为催化氧化还原体系，称为化学聚合。其中过硫酸胺产生游离氧原子，使单体成为具有游离基状态，从而发生聚合。TEMED，DMPN和三乙醇胺的作用是加速剂。分子氧阻止聚合，冷却也可使聚合速度变慢。对这些因素加以控制，聚合一般在1小时以内可以完成。2．光聚合光敏物质核黄素代替过硫酸铵作催化剂。核黄素经强光照射后引发自由基，后者使Acr形成自由基并聚合成凝胶。TEMED并非必需，但加入可加速聚合。 毕合生物（www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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