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科研实验_研实新虫 (小有名气)
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[交流]
Q-PCR干粉引物，如何溶解？保存温度和时间是多少？
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现代科研基本离不开分子实验，分子实验又基本离不开PCR，PCR肯定离不开引物了，今天给小伙伴们讨论收到引物的处理问题。 QPCR 干粉引物溶解稀释的一般方法如下： 收到引物后，在开启离心管盖前，在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时引物干粉散失。因为引物在干燥过程中，寡核苷酸在EP管底部形成白色片状沉淀。鉴于运输过程中沉淀会飘起，在打开管盖之前进行简短离心这一步骤至关重要。 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性要求较高，合成的 OD 数较大，建议分装，避免反复冻融。 引物一般配制成10-100umol/l。 引物的浓度可以通过以下公式计算：引物终浓度（μM）=所需引物量（μg）/引物分子量（g/mol）/反应体积（L）。可以根据引物的OD值和分子量来计算需要加入多少液体才达到100μM的浓度，但没必要学这个，一般公司都会直接给算好，在标签处标明需要加入多少液体溶解以达到100μM的浓度。 用哪种溶剂溶解引物？ 如果需要稀释引物，可以使用灭菌的去离子水或TE缓冲液（pH7.4-8.0）作为溶剂。其中，TE缓冲液比较稳定，能提供稳定的pH环境，适合于保存引物（以及质粒或基因组DNA），但也有人认为，TE中的EDTA分子会影响后续PCR的效率。 引物的保存温度和时间有什么限制？ 未溶解的引物在-20℃下可保存至少1年，溶解后的引物在-20℃下避免反复冻融，可以保存至少半年以上。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD值较大，建议将溶解好的引物事先稀释为100μmol/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10pmol/μl或20pmol/μl）后进行实验。 |
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