前段时间有个同学因为细胞状态不好,培养基里有小黑点,怀疑是支原体污染。于是检测了一下,果真是的,就买了支原体清除剂。别说效果还真好,3天后细胞状态就好了。
既然细胞状态好了,就停用了,没想到一停用,细胞状态就又差了。把培养箱、细胞房都清理一遍还是不行,就问到了我,既然这些因素都排除了,最后只有一个可能了,刚买的Gibco的胎牛血清,本来心里还想,同学实验室真是土豪啊,我就问了价格,南美胎牛1500……澳州胎牛血清3000……,简直惊讶到了,现在Gibco的血清简直是一货难求,澳州胎牛血清已经炒到了8000+了。
就断定这个血清肯定是假的,用检测试剂盒检测了一下,果然是这个问题,假血清真是害人啊,这些无良奸商……由于支原体比较小,滤器过滤不掉,所以大家买血清的时候一定要先试用,检测一下支原体(现在好多大牌子都会有支原体检测报告)
这里来分享一下支原体检测方法:
1,PCR检测法。
(1) 细胞铺24孔板,5x104个/孔;
(2) 每隔1d取细胞培养液留样,连取3d;
(3) 细胞培养液95℃水浴加热5min,12000rpm离心1min,取上清做下一步的巢式PCR检测;
(4) 巢式PCR第一轮体系和程序:
体系:模板:4步骤所得细胞培养液 2ul
Primer-F(10mM): 1ul
Primer-R(10mM): 1ul
dNTP Mixture(10mM each): 1ul
Taq酶(2u/ul): 0.5ul
10XTaq酶buffer: 5ul
H2O: 39.5ul
Total 50ul
程序: 95℃ 2min cycles 1x
95℃ 20S
55℃ 20S
72℃ 2min
72℃ 6min cycles 1x
4℃ hold
(5) 巢式PCR第二轮体系和程序:
体系:模板:一轮PCR产物 2ul
Primer-F2(10mM): 1ul
Primer-R2(10mM): 1ul
dNTP Mixture(10mM each): 1ul
Taq酶(2u/ul): 0.5ul
10XTaq酶buffer: 5ul
H2O: 39.5ul
Total 50ul
程序: 95℃ 2min cycles 1x
95℃ 20S
55℃ 20S
72℃ 1min
72℃ 6min cycles 1x
4℃ hold
(6) 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
2支原体检测跑胶图-20084539882.jpg
这个Primers 是依据支原体基因组中高度保守的 16SrRNA 编码域而设计的,只需简单的 PCR 反应就可检测 M.Arginini, M.Fermentans, M.Hyorhinis, M.Orale, M.Salivarium, M. Hominis, M.Pneumonia 等常见的支原体。
2,DNA萤光染色法
利用萤光染剂(bisbenzimide, Hoechst 33258)侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55~80%),所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。
MycoplasmaOUT处理细胞前
MycoplasmaOUT处理细胞后
由于是细胞里用的产品,抗生素类的最好谨慎使用,这里有个之前使用MycoplasmaOUT™,是抗菌肽类型的,处理时间也短,只要3天就可以了,而且对细胞也无毒无害。 |